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參考所用的二抗的使用說明，以及一抗的質(zhì)量和樣品中目的蛋白的含量，按照適當(dāng)比例例如1:1000、1:500等比例稀釋二抗。二抗稀釋后即可直接用于Western。一次Western結(jié)束后，可以回收稀釋的二抗，4℃保存，以用于下次的Western，通常在1-2周內(nèi)可以重復(fù)使用3-5次。
詳細(xì)的Western操作可以參考：

 Western實(shí)驗(yàn)步驟
Western，也稱Western blot、Western blotting、Western印跡，是用抗體檢測蛋白的重要方法之一。Western可以參考如下步驟進(jìn)行操作。
1.收集蛋白樣品（Protein sample preparation）
可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖?，例?font color="#4578aa">Western及IP細(xì)胞裂解液（P0013）、RIPA裂解液等，裂解貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提，例如細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒（P0028）。
收集完蛋白樣品后，為確保每個蛋白樣品的上樣量*，需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y定方法。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。如果使用Western及IP細(xì)胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S）。
2. 電泳（Electrophoresis）
（1） SDS-PAGE凝膠配制
SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制，也可以使SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（P0012A）。該試劑盒提供了除水和配膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度SDS-PAGE的配方。
（2） 樣品處理
在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料配制，也可以使用SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5X）（P0015）。
100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。
（3） 上樣與電泳
冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。
為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（P0066）。
電泳時電泳液可以使用SDS-PAGE電泳液（P0014A/P0014B）。
電泳時通常推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時使用高電壓恒壓電泳。對于Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設(shè)置在80-100V，高電壓可以設(shè)置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求，也可以采用多功能電泳儀（帶定時）（EEP102）。為了電泳方便起見，也可以采用整個SDS-PAGE過程恒壓的方式，通常把電壓設(shè)置在100V，然后設(shè)定定時時間為90－120分鐘。設(shè)置定時可以避免經(jīng)常發(fā)生的電泳過頭。
通常電泳時溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況，預(yù)計(jì)目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。
3. 轉(zhuǎn)膜（Transfer）
我們推薦在Western實(shí)驗(yàn)中選用PVDF膜（FFP30/FFP33）。硝酸纖維素膜（NC膜）（FFN06/FFN09）也可以使用，但硝酸纖維素膜比較脆，在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請參考生產(chǎn)商的推薦使用步驟。
通常如果使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置，可以設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300-400mA，轉(zhuǎn)膜時間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過夜。轉(zhuǎn)膜時也可以使用多功能電泳儀（帶定時）（EEP102）。具體的轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時間越短。
在轉(zhuǎn)膜過程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時，通常會有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。
轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，通常分子量zui大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液（P0022）對膜進(jìn)行染色，以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液（P0017）對完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。
4. 封閉（Blocking）
轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液（P0023C）中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。
用微型臺式真空泵（EVAC06/EVAC07）或滴管等吸盡洗滌液，加入Western封閉液（P0023B），在搖床上緩慢搖動,室溫封閉60分鐘。對于一些背景較高的抗體，可以4℃封閉過夜。在整個Western過程中我們推薦使用碧云天的側(cè)擺搖床（ESHK02）或類似儀器，側(cè)向擺動速度比較緩慢，而且也容易讓溶液覆蓋蛋白膜。
5. 一抗孵育（Primary antibody incubation）
參考一抗的說明書，按照適當(dāng)比例用Western一抗稀釋液（P0023A）稀釋一抗。
用微型臺式真空泵或滴管等吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果不佳，可以4℃緩慢搖動孵育過夜?；蚋鼡?jù)抗體的說明選擇適當(dāng)?shù)姆跤郎囟群蜁r間。
回收一抗。加入Western洗滌液（P0023C），在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。
注：Western結(jié)果通常需要提供內(nèi)參作為對照，通常可以選用Tubulin抗體（AT819）或Actin抗體（AA128），進(jìn)行內(nèi)參檢測。
6. 二抗孵育（Secondary antibody inucubation）
參考二抗的說明書，按照適當(dāng)比例用Western二抗稀釋液（P0023D）稀釋辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗。 二抗需根據(jù)一抗進(jìn)行選擇，例如，一抗是小鼠來源的IgG，則二抗需選擇抗小鼠IgG的二抗，如辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）（A0216）。我公司有多種二抗提供。
用微型臺式真空泵或滴管等吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。
回收二抗。加入Western洗滌液（P0023C），在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。
7. 蛋白檢測（Detection of proteins）
參考相關(guān)說明書，使用BeyoECL Plus（P0018）等ECL類試劑來檢測蛋白。壓片可以采用的壓片暗盒（FFC58/FFC83）進(jìn)行。
洗片時可以使用X光片自動洗片機(jī)。如果沒有自動洗片機(jī)，可以用顯影定影試劑盒（P0019/P0020）自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片。X光片推薦選用柯達(dá)原裝的生物實(shí)驗(yàn)柯達(dá)X-OMAT BT膠片（FF057/FF081）。
8. 膜的重復(fù)利用（Membrane recovery）
如果蛋白樣品非常寶貴，可以使用Western一抗二抗去除液（P0025）處理蛋白膜，以重復(fù)利用蛋白膜。